VERONICA - ČASOPIS PRO OCHRANU PŘÍRODY A KRAJINY

Mikrobiální život bují téměř v každém prostředí od půdy na našich zahradách až po mikrobiální společenstva v arktickém ledu. V současné době se vědci nemusejí spoléhat pouze na mikroskop, když chtějí zmapovat diverzitu (mikro)organismů na určitém místě. Stačí jim zjistit, čí DNA se na dané lokalitě objevuje. To umožňuje žhavá novinka molekulární genetiky - metabarcoding. S jeho pomocí lze zmapovat diverzitu lidské mikrobioty, mikroorganismů z tajemných hlubin oceánů, a dokonce i usuzovat na kvalitu vod.

Jak to funguje?

Pokud chceme najít stopy jakékoliv DNA v libovolném ekosystému (v rybníce, v půdním společenstvu atp.), lze použít skvělou moderní metodu s názvem metabarcoding. Každý druh organismu má totiž svou molekulární vizitku. Tento takzvaný barcode - v doslovném překladu čárový kód, tedy pro každý organismus jedinečný krátký úsek jinak nesmírně dlouhé dvoušroubovice DNA - nás informuje o tom, který organismus se nachází v našem vzorku. Podobně jako prodavač v obchodě načítá čárové kódy a vidí na obrazovce, které zboží si daný zákazník kupuje, i vědec pracující s výsledky DNA-metabarcodingu si může zobrazit názvy druhů organismů nebo vyšších taxonomických jednotek (řád, čeleď atp.) a dále je zkoumat.

Různými metodami sekvenování (tj. odhalování pořadí písmen genetické informace, probíhá ve speciálních laboratořích) objevíme ve vzorku třeba půdy či vody statisíce různých druhů. Nejprve ale musíme namnožit DNA ve vzorku. Používá se k tomu PCR (polymerázová řetězová reakce). Ano, stejně jako při testech na Covid-19!

PCR je proces množení genetické informace. Zjednodušeně se namíchá DNA s DNA-primery, které navedou enzym DNA-polymerázu, aby vytvořila miliony kopií úseků DNA s výše zmíněnými molekulárními vizitkami neboli barcody. Použitím této reakce získáme během několika hodin stovky milionů kopií barcodových úseků DNA. Po nalezení sekvencí ve (stále se rozšiřujících) databázích DNA je lze tzv. zarovnat a vytvořit fylogenetické stromy života, které nám odhalí příbuznost mezi organismy a případně časy, kdy se jejich linie v historii rozdělily na současné rody, druhy atp.

K čemu to tedy je?

Tato revoluční metoda má několik hlavních využití. Jedním z nich je Human Microbiome Project (HMP), rozsáhlý plán na sekvenování lidské mikrobioty (mikrobiomu). Mikrobiota je dodnes v popředí vědeckého zájmu. O rozmanitosti organismů, které obývají například naši kůži nebo trávicí soustavu, toho víme velmi málo (NIH HMP Working Group 2009). Zajímavým poznatkem vědy souvisejícím s lidskou mikrobiotou je například to, že žaludeční bakterie mohou vysílat nervové přenašeče, které vyprodukovaly, do mozku prostřednictvím bloudivého nervu. Schopnost produkovat tyto přenašeče byla dříve připisována pouze zvířatům. Panuje tedy obava, že bakterie mohou jako mikroskopičtí teroristé dobýt náš nervový systém (přinejmenším bloudivý nerv) a vyslat ve svůj prospěch libovolné množství např. dopaminu, který může změnit fyziologii mozku a následně i naše chování (Fülling et al. 2019). Velké množství druhů, jež jsou nalezeny pomocí metabarcodingu naší mikrobioty, jistě nabízí k objevení nepřeberné množství podobně zajímavých interakcí mezi mikroorganismy a člověkem.

Využití metabarcodingu ale není pouze doménou biologie člověka. Nezisková organizace TARA, která rozšiřuje povědomí o stavu a ochraně životního prostředí a podporuje vědecké projekty, vyslala plachetnici s veškerým vybavením pro metabarcodingové vysokokapacitní sekvenování, aby brázdila světový oceán od pólu k pólu. Na expedici TARA Oceans se vědci plavili přes 140 000 km, aby odebírali přes 35 000 vzorků ze dna i z vodního sloupce na mnoha lokalitách. TARA přispěla k pochopení biologické diverzity a rozšíření mikrobiálních společenstev ve světových oceánech. Výsledky expedice měly nesmírný ohlas. Existuje gradient biologické diverzity, jenž klesá od rovníku k pólům u suchozemských organismů. Tato hypotéza zde byla potvrzena i pro mořské mikroorganismy.

Dle mého názoru potenciál metabarcodingu netkví pouze ve studiích o diverzitě jako je TARA Oceans, ale zejména v tzv. biomonitoringu. To je hodnocení ekologického stavu a probíhajících změn v ekosystémech pomocí živých organismů. Zjednodušeně se dá říct, že některé organismy najdeme pouze v horských bystřinách s průzračnou vodou skoro bez živin a organických nečistot a jiné zase v rybnících plných živin a s vodním květem. Těmto organismům specializovaným na konkrétní podmínky říkáme bioindikátory. Standardně se při biomonitoringu pozoruje dané společenstvo bioindikačních řas nebo velkých bezobratlých pod mikroskopem či binolupou. Na základě jejich výskytu lze ohodnotit ekologický stav - tedy „čistotu“ prostředí. Dnes se ale nabízí možnost povolat na pomoc pracovníky DNA laboratoří a hledat organismy pod „genetickým mikroskopem“. Tam ale možnosti metabarcodingu nekončí.

Existuje i tzv. funkční metagenomika, tedy pozorování specifické enzymatické aktivity, nebo proteinů v prostředí. Zde už se vědci nesoustředí na úseky DNA, ale buď sekvence proteinových písmen, nebo písmen RNA. Známým příkladem je studie na pakomárech, údajně nejhojněji zastoupené skupině bezobratlých ve společenstvech na dně tekoucích vod. Larvy pakomárů ve stresu z látek jako např. bisfenol A, chlorid kademnatý, dusičnan olovnatý, dichroman draselný atp. vypouštějí hemoglobin a stresový protein HSP70. Výhodou této metody je rychlejší zachycení změn v ekosystému, než kdyby byly použity celé organismy jako bioindikátory, jelikož ty odpovídají na změny pomaleji (Lee et al. 2006).

Dalších využití metabarcodingu je mnoho. Od paleontologických studií až po analýzu potravy živočichů.

Pro a proti…

Metabarcoding je sice poměrně jednoduchá metoda (i když z vlastní zkušenosti vím, že tohle je spíš floskule omílaná ve vědecké literatuře) a poměrně levná záležitost. Další výhodou je, že tvoření kultur mikroorganismů z prostředí nikdy nezmapuje kompletní diverzitu prostředí - mnoho organismů dodnes zůstává nekultivovatelných.

No ale nasnadě je i jeden paradox a potenciální nešvar této metody. Sekvenujeme totiž veškerou DNA z prostředí, a tudíž i tu „zombickou“. DNA mrtvých organismů, jež byla do lokality sběru vzorku splavena bůhví odkud, nám nedává žádnou informaci o místní rozmanitosti života. Nedostatkem je i to, že v tzv. referenčních databázích pořád nemáme DNA všech organismů. Z TARA Oceans tedy např. víme, že diverzita řas zlativek je v mořích obrovská, ale jedná se o geneticky nepopsané/neznámé druhy. Na rozšiřování databází se v současné době intenzivně pracuje.

Závěrem

Metabarcoding se ukazuje jako levnější, rychlejší a v některých případech přesnější a spolehlivější alternativa k tradičním např. mikroskopickým technikám. S jeho pomocí lze odhalovat diverzitu mikroorganismů obývajících ekosystémy, jako jsou hlubiny oceánů, nebo dokonce i naše útroby. Jednou z jeho hlavních výhod je, že izolace veškeré DNA ze vzorku nám může pomoci odhalit druhy, které jsou v prostředí přítomny pouze v malých koncentracích a při pohledu pod mikroskopem nemusejí být ve vzorku vůbec zachyceny, takže odhalí přítomnost též invazních druhů, které se zatím v ekosystému objevují pouze v množství jen obtížně detekovatelném klasickou mikroskopií. Pro aplikaci v projektech na ochranu přírody je důležité, že stejně tak snadno odhalí i druhy vzácné. Přítomnost vzácných (mikro)organismů může být solidním argumentem pro ochranu celých ekosystémů.

Nevýhod této stále ještě nové metody se uvádí vícero, i když zásadní je dle mého riziko sekvenování DNA mrtvých buněk při biomonitoringu, která jako zombie stále nerozložená dlí v prostředí i po odumření své živé schránky.

Jan Fiedler (1999) studuje navazující magisterský obor protistologie na PřF Univerzity Karlovy. Zabývá se šířením mikroskopických sladkovodních řas pomocí ptáků a metabarcodingem mikroskopických společenstev.